Metody diagnostyczne SARS-CoV-2



Podstawową metodą rozpoznania aktywnego zakażenia SARS-CoV-2 jest diagnostyka molekularna z wykorzystaniem techniki łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym – RT PCR (ang. Real Time Polymerase Chain Reaction). Według zaleceń WHO materiałem do badań molekularnych mogą być m.in.:

  • aspirat przeztchawiczy,
  • plwocina nieindukowana,
  • popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL),
  • aspirat z nosogardła,
  • wymaz z gardła.

Materiał pobrany z dolnych dróg oddechowych charakteryzuje najmniejsze prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie ujemnych.

RT-PCR jest metodą pozwalającą na detekcję i powielanie określonych fragmentów DNA w warunkach laboratoryjnych. Umożliwia ona jednoczesne namnażanie tych fragmentów oraz monitorowanie ilości produktów powstających podczas kolejnych cykli reakcji. Technika ta charakteryzuje się wysoką czułością i precyzją, co umożliwia przeprowadzenie analizy nawet przy niewielkiej ilości materiału genetycznego. Z powodzeniem wykorzystywana jest w diagnostyce innych zakażeń czy identyfikacji mutacji genetycznych. W technice RT-PCR ważne jest zarówno właściwe przygotowanie materiału do oznaczeń, jak również utrzymanie określonych parametrów reakcji oraz wykorzystanie odpowiednich składników tworzących tzw. mieszaninę reakcyjną. Nieprzestrzeganie procedur może doprowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych lub uzyskania wartości zaniżonych, co w konsekwencji prowadzi do postawienia błędnej diagnozy.

RT-PCR jest reakcją przebiegającą w kilku etapach. Jeżeli mamy do czynienia z próbką zawierającą materiał genetyczny w postaci DNA – od razu przechodzimy do właściwej procedury, jeśli jest nim RNA (tak jak w przypadku koronawirusów), należy przeprowadzić najpierw procedurę, tzw. odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription).  Jest to proces przepisania jednoniciowego wirusowego RNA przez enzym odwrotną transkryptazę na dwuniciowy cDNA, który jest następnie poddawany dalszej analizie.

Do przeprowadzenia reakcji PCR w czasie rzeczywistym, potrzebujemy:

  • badaną próbkę (np. wymaz z gardła),
  • mieszaninę nukleotydów niezbędną do syntezy nowej nici DNA,
  • bufor (roztwór zapewniający odpowiednie warunki do przeprowadzenia reakcji),
  • primery, czyli startery reakcji – krótkie fragmenty oligonukleotydowe wysoce specyficzne do szukanej sekwencji, którą chcemy powielić,
  • sondę wyznakowaną fluorescencyjnie (odpowiadającą za detekcję specyficznych regionów w obrębie sekwencji),
  • termostabilną polimerazę, enzym odporny na działanie temperatury, który łącząc się z odpowiednim starterem, umożliwia dobudowywanie nowej nici w fazie wydłużenia. Ponadto odpowiada za degradację sondy, oddzielając tzw. wygaszacz (ang. quencher) od związanego z nią barwnika fluorescencyjnego (ang. reporter dye), co pozwala na emisję fluorescencji.

Przygotowaną mieszaninę należy umieścić w tzw. termocyklerze zapewniającym odpowiednie warunki reakcji. Do zachowania właściwego przebiegu reakcji, konieczne jest utrzymywanie optymalnej temperatury na poszczególnych jej etapach (ryc. 1):

  • denaturacji – podczas której dochodzi do rozdzielenia podwójnej nici DNA,
  • przyłączania – gdy odpowiednio zaprojektowane primery oraz wyznakowana fluorescencyjnie sonda wiążą się do określonych miejsc na sekwencji nukleotydowej,
  • wydłużania – czyli dobudowywania nowej nici do pojedynczej – już istniejącej, w obecności polimerazy.

Na każdym etapie reakcji możemy monitorować intensywność emitowanej fluorescencji, która następnie przeliczana jest na wartości liczbowe. Im większa intensywność, tym większa wartość liczbowa, a co z tym związane – większa ilość kopii DNA wirusowego w analizowanej próbce, wyrażona w jednostkach objętości.

Ryc. 1. Schemat przedstawiający poszczególne etapy reakcji PCR w czasie rzeczywistym [opracowanie własne].

Technika PCR w czasie rzeczywistym jest obecnie jedyną rekomendowaną metodą diagnostyki zakażenia wirusem SARS-CoV-2. Wadami tej metody wydają się być wymagania sprzętowe oraz wysoki koszt i czas trwania analizy.

Do alternatywnych metod diagnozowania możemy zaliczyć testy serologiczne, które wykrywają przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na infekcję (ryc. 2). W celach diagnostycznych powinny być to testy wykrywające wyłącznie przeciwciała klasy IgM. Testy IgM/IgG nie powinny być wykorzystywane jako podstawa do diagnozowania lub wykluczania zakażenia SARS-CoV-2. Należy pamiętać, że wynik dodatni może świadczyć o przebytym, a nie aktywnym zakażeniu, bądź zakażeniu innymi szczepami koronawirusa (HKU1, NL63, OC43 lub 229E). Natomiast wynik ujemny, ze względu na nieznaną dotychczas dynamikę odpowiedzi immunologicznej po kontakcie z SARS-CoV-2, nie wyklucza w 100% zakażenia, co może skutkować postawieniem błędnej diagnozy.

Ryc. 2. Wykres przedstawiający okres powstawania przeciwciał IgM i IgG w odpowiedzi na zakażenie.

Przeciwciała klasy IgM stanowią laboratoryjny wyznacznik świeżego zakażenia. Występują głównie w odpowiedzi pierwotnej, ich obecność świadczy o ostrym procesie chorobowym. Przeciwciała klasy IgG – pojawiają się we krwi chorego w później fazie, jako odpowiedź wtórna i ich stężenie szybko narasta w trakcie infekcji.

Do czasu wprowadzenia szczepień, testy serologiczne miały zastosowanie praktyczne jedynie przy potwierdzeniu przebytej infekcji, głównie w przypadku infekcji bezobjawowych lub o łagodnym przebiegu. Obecnie, testy serologiczne potwierdzają też wytworzenie przeciwciał w odpowiedzi na szczepienie. U pacjentów, którzy przebyli zakażenie przeciwciała IgG mogą być skierowane przeciw różnym elementom wirusa, m.in. białkom nukleokapsydu (N). U osób zaszczepionych pobudzana jest tylko produkcja tych skierowanych przeciwko białku S. W związku z powyższym, ocena przeciwciał IgG skierowanych przeciwko S1 oraz N pozwala na rozróżnienie szczepionych, którzy nie przeszli w przeszłości zakażenia SARS-CoV-2 (IgG antyN – negatywne, IgG S1 – pozytywne) od osób tych, którzy mieli kontakt z wirusem (IgG antyN – pozytywne, IgG S1 – pozytywne). Istnieją też testy umożliwiające ilościowe określenie stężenia przeciwciał IgG specyficznych dla podjednostek S1 i S2 białka S koronawirusa. Przeciwciała IgG pojawiają zwykle już 2 tygodnie po pierwszej dawce szczepienia, jednak nie świadczą o uzyskaniu odporności na zakażenie. Do tego potrzebna jest jeszcze odpowiedź komórkowa, której nie da się dokładnie zbadać. Pełen efekt produkcyjny przeciwciał uzyskuje się dopiero 1-2 tygodnie po drugiej dawce.

Kolejnym rodzajem testów są testy antygenowe, które polegają na wykrywaniu białek wirusa w wymazie pobranym z nosa i gardła. W teście antygenowym wykorzystywane są specyficzne przeciwciała, które wiążą się z określonym białkiem wirusa. Główną zaletą tych testów jest krótki czas oczekiwania na wynik oraz niższa cena, a co z tym związane – ich większa dostępność.  Niestety wciąż nie jest znana ich czułość ani swoistość. Przewiduje się, że wynosi ona około 75-85% co oznacza, że na 100 wyników 75-85 zostało rozpoznanych prawidłowo (wynik prawdziwie dodatni lub ujemny). Istnieje więc spora część wyników (nawet 25%), które mogą być fałszywie dodatnie lub ujemne. Trwają badania walidacyjne, porównujące wyniki testów antygenowych i molekularnych na dużych grupach pacjentów.

Piśmiennictwo:

  1. who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019
  2. CDC Tests for COVID-19. https://www.cdc.gov
  3. Hadaya J, Schumm M, Livingston EH. Testing Individuals for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). JAMA 2020; 323: 1981.
  4. Loeffelholz MJ, Tang YW. Laboratory diagnosis of emerging human coronavirus infections – the state of the art. Emerg Microbes Infect 2020; 9: 747.

Opublikowano: 22 lutego 2021